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“GST亲和层析介质”详细介绍
简介
GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。
适用范围
分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。
玻璃层析柱
1）将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。
2）先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3）从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。
4）在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。
4.过柱：
1）用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质；
2）上样；
3）用5~10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；
4）用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液；
5）用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。
注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。
1）沉淀或变性物质的清洗：
用2倍介质体积6 M盐酸胍清洗，然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
2）疏水缔合物质的清洗：
用3~4倍介质体积70%乙醇（或2倍介质体积去垢剂，如 1%Triton？X-100）清洗介质；然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
介质保存
4℃~8℃条件下，介质可长期保存于20%乙醇中。1.低分子量Marker；2.上样液；3.GST-流穿液；4.GST-洗脱液；5.对照-流穿液；6.对照-洗脱液
GST亲和层析介质使用注意事项
1.GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间，因而在上样时要维持较低流速。在样品中加入5~10mM DTT可以增加介质对目标蛋白的吸附。对于按常规步骤操作吸附效果不好的样品，可以先把介质和样品混合，轻轻振摇2~4h，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作。
2.不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时需对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。
3.GST融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。纯化效果取决于复性效率。
4.纯化后出现杂带的常见原因
1）目标蛋白断裂或酶解
解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％Tween-20等稳定剂。
2）GST融合蛋白不完全表达
GST融合蛋白有时候只表达到GST部分就终止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与介质结合并被洗脱下来，因而洗脱液中出现26KD左右的杂带。
解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱；优化表达条件，降低GST融合蛋白不完全表达量；改变外源基因在载体中插入的酶切位点，重新构建表达载体；在不改变外源基因两端酶切位点的情况下，更换通用载体。
5.如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。
GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白中切除。蛋白酶解后，再用GST亲和层析方法去除GST标签，目标蛋白存在于流出液中。一般情况下，与切除GST标签后得到的外源蛋白相比，凝血酶用量极小，如果后续实验要求不严格，不需进一步除去与外源蛋白共存与洗脱液中的凝血酶。如需除去凝血酶，则可将样品用pH7~8的缓冲液溶解，然后直接过1ml的苯甲脒琼脂糖凝胶或者肝素琼脂糖凝胶吸附凝血酶。
GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。
适用范围
分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。
玻璃层析柱
1）将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。
2）先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3）从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。
4）在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。
4.过柱：
1）用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质；
2）上样；
3）用5~10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；
4）用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液；
5）用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。
注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。
1）沉淀或变性物质的清洗：
用2倍介质体积6 M盐酸胍清洗，然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
2）疏水缔合物质的清洗：
用3~4倍介质体积70%乙醇（或2倍介质体积去垢剂，如 1%Triton？X-100）清洗介质；然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
介质保存
4℃~8℃条件下，介质可长期保存于20%乙醇中。1.低分子量Marker；2.上样液；3.GST-流穿液；4.GST-洗脱液；5.对照-流穿液；6.对照-洗脱液
GST亲和层析介质使用注意事项
1.GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间，因而在上样时要维持较低流速。在样品中加入5~10mM DTT可以增加介质对目标蛋白的吸附。对于按常规步骤操作吸附效果不好的样品，可以先把介质和样品混合，轻轻振摇2~4h，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作。
2.不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时需对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。
3.GST融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。纯化效果取决于复性效率。
4.纯化后出现杂带的常见原因
1）目标蛋白断裂或酶解
解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％Tween-20等稳定剂。
2）GST融合蛋白不完全表达
GST融合蛋白有时候只表达到GST部分就终止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与介质结合并被洗脱下来，因而洗脱液中出现26KD左右的杂带。
解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱；优化表达条件，降低GST融合蛋白不完全表达量；改变外源基因在载体中插入的酶切位点，重新构建表达载体；在不改变外源基因两端酶切位点的情况下，更换通用载体。
5.如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。
GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白中切除。蛋白酶解后，再用GST亲和层析方法去除GST标签，目标蛋白存在于流出液中。一般情况下，与切除GST标签后得到的外源蛋白相比，凝血酶用量极小，如果后续实验要求不严格，不需进一步除去与外源蛋白共存与洗脱液中的凝血酶。如需除去凝血酶，则可将样品用pH7~8的缓冲液溶解，然后直接过1ml的苯甲脒琼脂糖凝胶或者肝素琼脂糖凝胶吸附凝血酶。
